564期-1:【技術】血流感染分子診斷的研究進展

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血流感染(blood stream infection)是一種嚴重的全身感染性疾病,其中僅有30%~40%的血流感染者可以通過培養的方式發現致病菌[ 1, 2]。引起血流感染的微生物包括細菌、真菌、病毒及寄生蟲,陽性血培養可為臨床提供病原學診斷的依據。血流感染初期的24 h內,若未能及時進行早期診斷以及合理的抗菌藥物治療將會導至患者存活率大大下降[ 3]。

雖然血培養仍然是目前診斷細菌性血流感染的金標準,但血培養的陽性檢出率不高,檢測時間過長(陽性報警需要1~5 d,甚至更長),無法滿足臨床早期、快速診斷以指導治療的需要。同時也不適合臨床實驗室對不易培養的微生物的及時檢出,如軍團菌屬( Legionella spp.)、巴爾通氏體屬( Bartonella spp.)和曲霉屬真菌( Aspergillus spp.)等[ 1]。分子生物學檢測技術的發展旨在增加病原體檢測的敏感性和特異性,擴大檢測的病原譜,縮短檢測時間,減少抗菌藥物對病原體檢測的抑制作用[ 2, 3]。理想的分子生物學方法可通過分析患者的血液標本,快速提供準確的細菌、真菌或病毒感染信息,甚至提供常見致病菌的耐藥基因檢測結果,指導臨床醫生及時、準確地使用抗菌藥物進行抗感染治療。更為理想化的結果是對全血標本檢測的同時提供感染細菌的定量等數據,用于評估微生物治療后的血液清除率。

當前,應用于臨床實驗室血流感染檢測的分子生物學技術主要包括基于病原微生物DNA或RNA的檢測技術如核酸雜交(nucleic acid hybridization)、核酸擴增及DNA序列分析、基因芯片和以蛋白質組學為基礎的質譜檢測技術等。

一、核酸雜交技術

核酸雜交是指具有一定互補序列的2條核酸單鏈在液相或固相體系中按堿基互補配對原則形成同源或異源雙鏈分子的過程。核酸雜交可在DNA與DNA、RNA與RNA或RNA與DNA的2條單鏈之間進行。其中,熒光原位雜交技術應用于臨床實驗室鑒定工作已有10余年,其檢測的敏感性和特異性可達到96%~100%[ 4]。在第1代熒光原位雜交技術(peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization, PNA-FISH)的基礎上[ 5, 6],第2代熒光原位雜交技術(quick- fluorescent in situ hybridization, Quick-FISH)已能更好地滿足臨床實驗室對操作簡便、快速的需求[ 4]。不同于美國研發的第1代PNA-FISH (AdvanDX,MA,美國)檢測技術,Quick-FISH省去了雜交后的30 min清洗環節,采用了“自我報告”探針,同時將雜交時間節省到了15 min。這將大大提高對血培養陽性的革蘭陰性細菌如大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌,以及革蘭陽性細菌如金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌的檢測效率,同時簡便的操作也將更有利于該技術的推廣。

Deck等[ 4]在Quick-FISH的基礎上,使用葡萄球菌快速檢測技術( Staphylococcus Quick-FISH)可以在30 min內快速鑒定金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌,其檢測敏感性達到99.5%和98.8%。Quick-FISH檢測技術與聚合酶鏈反應 (polymerase chain reaction,PCR)聯合使用時優勢更加明顯[ 7],如檢測陽性標本中金黃色葡萄球菌的 mecA基因、耐萬古霉素基因 vanA和 vanB等,快速診斷提供合理用藥的重要提示對患者的預后有重要意義。

二、核酸擴增及DNA序列分析

PCR是一種體外核酸擴增技術。目前,PCR已成為分子生物學及其相關領域的經典試驗方法,由PCR演變的相關核酸擴增技術也逐步在臨床微生物學檢驗領域得到應用。PCR在血流感染微生物檢測和鑒定中的應用體現在3個方面:一是對分純的病原菌鑒定;二是對血培養陽性培養物快速鑒定;三是對臨床標本中難以培養病原菌進行檢測和鑒定?？赏ㄟ^2種方式檢測和鑒定病原微生物,一是使用特異引物擴增檢測病原微生物目標基因[ 8];二是使用通用引物擴增檢測細菌16 S rRNA和真菌 ITS及5 .8 S、26 S rRNA等基因D1/D2序列,同時進行測序分析[ 9, 10, 11, 12]。

檢測特異性目標基因需要合成相關病原微生物的特異性引物或購買有關試劑盒,核酸擴增反應體系條件不盡相同。Sidor等[ 8]研究發現,對布魯菌 bcsp31基因設計特異性引物,可以通過PCR的方式快速檢測血液、組織等標本中的布魯菌,敏感性和特異性分別達到70.4%和98.3%。

Springer等[ 9]通過PCR的方法檢測了803例侵襲性曲霉病患者的全血和血清標本中的曲霉菌 ITS1 -5 .8 S rRNA后發現,全血標本中曲霉菌檢測陽性率可達到85%,略好于血清標本的79%。使用通用引物擴增檢測細菌16 S rRNA基因,再進行基因序列測定、計算機分析和比對,最終鑒定病原微生物,其核酸擴增反應體系條件較易掌控,應用范圍廣,可以發現新的菌種。Karah等[ 10]對2005至2007年挪威的113例不動桿菌屬血流感染患者研究發現,使用PCR方法可以快速檢測血培養陽性瓶中的鮑曼不動桿菌等。對于碳青霉烯類常見的耐藥突變基因 bla OXA-51 -like進行測序,有助于早期報告耐藥菌以提示臨床合理用藥。對全麻拔牙患者的血流感染風險研究顯示,使用通用引物檢測全血標本中的16 S rRNA,結合焦磷酸測序技術可以很好的發現草綠色鏈球菌等,對于評估血流感染有重要意義[ 11]。Jeng等[ 12]在對血流感染病例的研究中發現,使用高分辨率熔解曲線分析(high-resolution melt analysis,HRMA) PCR檢測沙門菌的16 S rRNA可有效地檢出致病菌。

由德國公司開發的SepsiTestTM 檢測試劑盒,采用3對引物特異性地擴增全血標本中致病菌的16 S rRNA、18 S rRNA序列,通過測序后在線BLAST比對便可以準確地鑒定血流感染致病菌。隨著測序技術的不斷發展和16 S rRNA數據庫的不斷完善,基于細菌16 S rRNA基因的PCR擴增與測序分析在臨床細菌分類和鑒定中的應用會越來越廣,尤其在臨床少見菌、苛養菌以及固體培養基不生長細菌的鑒定、檢測和新菌種發現方面具有獨特優勢。

三、實時熒光PCR測定

實時熒光PCR對于傳統PCR技術進行的改進是為了提高PCR的敏感性、特異性和檢測速度以及避免污染。實時系統提供了一個封閉的環境,運用熒光共振散射轉移探針、分子信標或TaqMan探針(Roche molecular systems)檢測擴增產物[ 13, 14, 15]。分子信標探針是單股探針,內部有識別序列,當該分子信標探針與含核酸補充序列PCR產物接觸,探針即打開與PCR產物結合,其內所含的報告基團釋放熒光指示劑,即可產生可測量的熒光信號。隨著PCR反應的進行,熒光信號不斷累積。

目前,實時熒光PCR已經廣泛應用于血液中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)、人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)等病毒檢測,在血流感染致病菌檢測方面新產品不斷被開發推廣[ 15, 16, 17]。其中,羅氏公司產品Light Cycler? SeptiFast (LCSF) Test (Roche molecular systems, 瑞士)可在6 h內直接檢測覆蓋90%血流感染常見致病菌的25種細菌或真菌[ 1]。該試劑盒可檢測的致病菌包括革蘭陰性細菌(大腸埃希菌、克雷伯菌屬、黏質沙雷菌、奇異變形桿菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌等)、革蘭陽性細菌(金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、肺炎鏈球菌、糞腸球菌、屎腸球菌等)和真菌(白念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌等)。雖然該產品的檢測敏感性可以達到300 cfu/mL,且不受血液中PCR抑制物干擾,但由于儀器、試劑費用昂貴,臨床廣泛應用較為困難。

特異性擴增致病菌的16 S rRNA結合實時熒光PCR檢測平臺,可以更加高效、準確地檢測血流感染致病菌,甚至可以對常見耐藥基因 mecA、 vanA、 vanB、 vanC1和 vanC2 /C3進行有效地檢測[ 13, 14, 18]。Steindor等[ 13]對511份血培養陽性瓶的病原菌檢測結果顯示,16S rRNA結合實時熒光PCR對革蘭陰性和陽性細菌的檢測敏感性分別為96.1%和89.9%,可有效檢測92.9%病原菌中的 mecA基因。整個檢測結果的獲得,僅需要在血培養陽性后的4 h內完成。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的快速檢測對臨床準確合理用藥很關鍵,使用Prove-itTM Bone & Joint assay檢測系統可以及時準確地分析血流感染細菌的耐藥性,指導臨床有效治療[ 16, 19]。韓國研發的血流感染致病菌檢測試劑盒實時熒光PCR TaqMan assay (M&D, Wonju, 韓國),可以準確、快速地檢測出血流感染的革蘭陽性、陰性細菌和部分真菌,總體檢測的敏感性在試劑應用時可以達到99.6%[ 20]。

四、基因芯片(gene chip)

基因芯片也稱DNA微陣列(DNA microarray),可分固相基因芯片和液相基因芯片?；蛐酒瑱z測基本原理是將已知的核酸片段固定在一定的固相支持物表面制成核酸探針,利用堿基互補原理,使其與待測DNA標本進行雜交反應,從而獲得需要的生物學信息。與傳統的核酸印跡雜交方法相比,基因芯片檢測技術具有高通量、多參數同步分析、快速全自動分析、高精確度和高敏感性分析等顯著特征。液相基因芯片是近年來發展出的一種新的芯片技術,與固相芯片相比,液相芯片在反應動力學、反應速度、檢測敏感性、穩定性以及自動化程度方面都有較大的優越性。

目前,檢測病原體的芯片技術對靶基因的選擇有2種策略:一種是選擇細菌的核糖體基因(如16 S rRNA),另一種是選擇細菌的“特異基因”?；蛐酒部捎糜诓≡⑸锬退幓虻谋磉_譜檢測、突變分析等。目前,商品化基因芯片血流感染病原體檢測均應用于陽性血培養物,芬蘭Prove-itTM Sepsis assay (Mobidiag,芬蘭)通過多重PCR和雜交的方式,可在3.5 h內鑒定19種革蘭陰性菌,15種革蘭陽性菌,8種真菌和 mecA、 vanA、 vanB耐藥基因,敏感性和特異性分別達到94.0%和98.0%[ 1]。法國生物梅里埃公司新收購的Film Array BCID Panel 則在1 h左右可檢測包括 mecA、 vanA、 vanB、 kpc耐藥基因及革蘭陰性菌、革蘭陽性菌和真菌在內的27種病原菌。

Samuel等[ 21]使用Gram-Positive Blood Culture (BC-GP) assay試劑盒 (Nanosphere Inc., Northbrook, IL)對203例革蘭陽性菌血流感染的患者進行檢測,發現12 h內可以獲得12種不同的葡萄球菌屬、鏈球菌屬和腸球菌屬細菌的檢測結果。對耐藥致病菌的耐藥基因檢測結果顯示, mecA、 vanA/B基因的檢測陽性率分別可以達到92%和100%。芯片技術快速、高通量、靈敏的優勢使其具有極大的應用前景。

五、質譜技術

除了基因分析,蛋白組學作為一種日益重要的技術已應用于病原微生物的鑒定和分型分析。近年來,基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix assisted laser desorption ionization time off light mass spectrometry, MALDI-TOF MS)技術在細菌和真菌等微生物鑒定中的應用受到廣泛關注[ 22]。質譜技術主要是利用特定離子源將待測標本轉變為運動的離子,這些離子根據質量/電荷比的不同,在電場或磁場作用下得到分離,并用檢測器記錄各種離子的相對強度,形成質譜圖,通過與已知數據庫進行匹配,匹配率最高的為未知微生物的鑒定結果。它具有高敏感性、高通量和快速的特點,但由于其對未知微生物的鑒定是通過所獲得的質譜圖與已知數據庫進行匹配分析來實現的,不同的標本制備方法對獲得的待測標本質譜信息有明顯影響,而相關數據庫的構成和質量則影響鑒定的準確性。

由日本島津公司發明的MALDI-TOF在2002年獲得了諾貝爾獎。VITEK MS 快速微生物質譜鑒定系統由電腦和MALDI-TOF兩部分組成。VITEK MS開啟了微生物研究新時代,將質譜技術實現于臨床細菌檢測和鑒定的常規分析,可同時檢測192個標本,大大提高了檢測效率。2007年,布魯克公司推出的MALDI Biotyper高通量微生物鑒定系統可以滿足微生物的快速鑒定與分類的需求。該系統包括MALDI-TOF MS儀和Biotyper數據庫,具有快速、簡便的工作流程和強大、可靠的數據處理能力,是微生物鑒別與分類中的最新技術。目前數據庫中已經含有常見的近4 000種微生物的特征指紋圖譜,而且還在不斷增加中。此外,用戶可以根據自己的需要,輕松地添加所獲得的新的微生物特征指紋圖譜,并用于日常檢測、鑒定工作中。從臨床實驗室純分的微生物單菌落鑒定到血培養陽性瓶培養物中病原微生物鑒定,MALDI-TOF MS的應用均有許多報道。最近已有臨床實驗室嘗試用MALDI-TOF MS檢測碳青霉烯類耐藥基因和超廣譜β-內酰胺酶(extended spectrum beta lactamases,ESBLs)的活性。

一種新型的多聚合酶鏈反應藕聯電噴質譜電離技術( eectrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS)榮獲了2009年美國科技金獎,該技術能夠通過快速、高通量、精確的數字分析,檢測和鑒定臨床及環境中分離的菌株或標本中的病原微生物,并能定量鑒定對人和動物致病的病原微生物。該技術鑒定病原微生物快速、準確、敏感性好、特異性高,通常不需要測序,更適用于預先無法確定病原方向的突發疫情和不明原因感染的診斷。該技術從標本中制備核酸,選擇特異性的核苷酸引物進行多重PCR擴增,之后對擴增產物進行全自動的ESI-MS分析檢測,質譜儀可對擴增產物進行準確至堿基組成的精確定量,所獲數據與經校準過的已知微生物標準數據庫進行比對,便可確定所檢測病原微生物的種類。Schubert等[ 22]對MALDI-TOF MS檢測標本制備進行了一定的改進,更加準確、快速地用于直接檢測血培養陽性標本。Jeng等[ 23]在比較研究PCR-HRMA(PCR coupled to high resolution melting curve analysis)檢測技術和PCR- ESI-MS方法時發現,兩者在檢測致病菌的敏感性均能達到90.0%以上,PCR-ESI-MS的特異性能達到98.5%[ 24],但是PCR- ESI-MS可以有效地檢測多種致病菌混合感染的標本。與MALDI-TOF-MS比較,在菌屬和菌種水平正確率PCR-ESI-MS均高于MALDT-TOF-MS[ 24, 25],在血培養陽性細菌的鑒定能力和速度上2種技術無明顯差別,均顯示了快速、準確的優勢。在培養陰性或難培養的致病菌檢測方面,PCR-ESI-MS能夠診斷并定量。然而,該技術極其昂貴的儀器和封閉試劑成為在發展中國家甚至歐美國家臨床實驗室應用最大的瓶頸。

六、GeneXpert分枝桿菌檢測平臺

隨著獲得性免疫缺陷綜合征和結核病疫情的日益嚴重,在臨床發現的分枝桿菌血流感染病例越來越多,已經成為臨床診斷、治療的一個難點,早期診斷的需求異常緊迫[ 26]。結核分枝桿菌生長緩慢,其快速、準確的檢測和耐藥性分析越來越成為實驗室進行結核診斷的重點。美國Cepheid公司開發的Xpert MTB/RIF assay試劑盒適用于GeneXpert儀器,可以在2 h內直接從患者痰液中檢測結核分枝桿菌及其對利福平的耐藥性。整個檢測過程都在密閉環境中進行,手動操作時間短(不超過5 min),對操作者和周圍環境安全。

Feasey等[ 26]在GeneXpert MTB/RIF assay檢測儀器的基礎上,對血流感染的分枝桿菌進行了研究。對44例痰培養分枝桿菌陽性患者的血液標本檢測陽性率為21%,2周后血液標本檢測陽性的患者死亡率顯著高于陰性患者。Banada等[ 27]對GeneXpert MTB/RIF檢測系統檢測分枝桿菌能力做了進一步的評估,使用卡介苗作為模式菌,在血液標本中進行檢測,細菌濃度分別為10、5、1和 0.25 cfu/mL時,檢測的敏感性分別達到100%、100%、83%和57%,而同樣濃度的細菌在1 mL血液標本的檢測敏感性只能達到100%、66%、18%和18%。研究發現血液標本中往往能檢測到MicroRNAs (miRNAs),這也是分枝桿菌感染的重要檢測標志物。對于活動性肺結核患者的血液標本研究發現,與疾病相關的miRNA-29a可能作為區分結核感染和健康人群的特異性指標,對于診斷活動性肺結核具有重要意義[ 28]。這也必將為分枝桿菌,甚至苛養菌、少見菌等難培養細菌的血流感染提供了一個新的發展思路。

隨著對微生物基因組學和蛋白質組學了解的深入,相信在不遠的將來,人們能夠快速、準確地對血流感染病原體同步進行檢測、鑒定及藥物敏感性測定,分子技術將成為血流感染診治必不可少的重要工具。多種檢測技術的聯合應用,對血流感染病原菌的快速檢測以及常見耐藥基因的快速檢測,必將能實現在較短的時間內(1 d,甚至數小時)為臨床實驗室提供可靠的血流感染診斷結果,有效地提示臨床合理用藥、及時診治,有效提高血流感染患者的生存率。

來源：《檢驗醫學》雜志 作者：上海市東方醫院南院醫學檢驗科 郭建綜述, 吳文娟審校

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